研究簡介：選擇性和滲透率通過界面聚合，制備了頂層薄而致密的復合膜。雖然優(yōu)化這種膜是很先進的，但在這種密集的選擇層上傳輸需要高跨膜壓力和高能量消耗。在細胞尺度上，生物膜滿足上述許多標準。生物膜將細胞或細胞組分分開，并且主要由厚度小于10nm的致密磷脂雙層組成。磷脂雙層包含膜蛋白，其使得信號傳遞和分子選擇性轉運穿過膜。連接膜兩側的膜蛋白被稱為跨膜蛋白，并且一些跨膜蛋白（TP）形成納米孔。研究人員將鐵蛋白聚合物偶聯(lián)到超薄膜上，并通過蛋白質變性形成納米孔。使用天然成孔跨膜蛋白代替鐵蛋白，合成了跨膜蛋白（TP）聚合物綴合物，其通過在Pickering乳液界面處的組裝和隨后的聚合物鏈的UV交聯(lián)轉化成穩(wěn)定的膜。提出了一個簡單的方法集成到平面超薄膜的功能性跨膜蛋白（TP），這種策略是基于Langmuir技術和同雙官能團交聯(lián)劑戊二醛，是一種有效的蛋白質交聯(lián)劑和已知的不影響蛋白質構象在許多情況下。在研究中，F(xiàn)huA分子在朗繆爾槽的空氣-水界面處鋪展。在用Langmuir槽的兩個可移動屏障壓縮時，形成致密的2D膜并通過戊二醛交聯(lián)穩(wěn)定。使用Langmuir-Schaefer方法將單層或多層交聯(lián)的FhuA膜轉移到各種基底材料上。

Kibron LB 膜分析儀的的應用

用乙醇徹底清潔Langmuir槽，用Millipore純水沖洗，并填充磷酸鹽緩沖液。隨后，將Langmuir槽的屏障完全封閉，吸附的顆粒從空氣-水界面吸走，磷酸鹽緩沖液從屏障后面重新填充。重復該過程，直到在完全屏障壓縮時測量的清潔空氣-水界面的表面壓力的上升小于或等于0.05mN/m-1在典型的膜制造實驗中，將50μL FhuA溶液（FhuA濃度為6.3×10-6 M的MPD緩沖液中）加入到反應器中。平衡2小時后，將朗繆爾槽的屏障設置為以1 mm/min的速度運動將吸附的FhuA單層壓縮至25 mN/m的表面壓力，在保持表面壓力恒定的同時，將1.76mL戊二醛溶液（50wt%的H2O溶液）加入到反應器中。在空氣中干燥之前，將轉移的FhuA膜在MPD溶液（5%體積MPD的Millipore純水溶液）中通過浸漬三次來洗滌。平衡2小時后，Langmuir槽的屏障以1 mm min-1的速度運動，將吸附的FhuA單層壓縮到25 mN m-1的表面壓力。在保持表面壓力不變的情況下，將1.76 mL戊二醛溶液(50 wt%in H2O,Sigma-Aldrich,USA)從Langmuir槽屏障后注入磷酸鹽緩沖亞相。交聯(lián)至少進行2小時，直到FhuA膜按照Langmuir-Schaefer方法轉移到相應的底物上。在空氣中干燥之前，將轉移的FhuA膜在MPD溶液(5 vol%MPD在Millipore純凈水中)中浸洗三次。

實驗結果

介紹了一種制造超薄但機械穩(wěn)定的膜的新方法，該膜包含TP FhuA，其天然形成限定的納米孔。由于其厚度低和本研究中推斷的極高密度的集體對齊蛋白質，與常規(guī)納濾膜相比，這種膜具有非常高的水滲透性。由兩種不同的FhuA變體制成的膜反映了每種變體的分子性質，在此關于離子滲透性進行了證明。我們的膜有潛力作為一個平臺技術，允許定制膜根據(jù)個人的過程要求。膜制造使用了研究良好的Langmuir技術和一個共同的蛋白質交聯(lián)劑，這確保了良好的可擴展性，著眼于未來的應用。

圖1、跨膜蛋白FhuA的交聯(lián)2D膜片。a）使用β-桶蛋白FhuA（跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A）的兩種變體。在FhuA WT中，軟木結構域阻塞大部分孔內(nèi)部，而該軟木結構域被生物技術去除以形成開孔變體FhuA?CVF電子伏特兩種FhuA變體具有相同的尺寸，并且其特征在于蛋白質上部的親水性環(huán)區(qū)和蛋白質下部的疏水性跨膜區(qū)。b）應用Langmuir技術形成超大2D FhuA膜片。（i）由于它們的兩親性，當擴散到空氣-水界面時，F(xiàn)huA分子占據(jù)很大程度上直立的取向。（ii）當在朗繆爾槽的屏障之間緊密壓縮并與戊二醛交聯(lián)時，F(xiàn)huA膜片可以通過重復的水平浸漬層疊在基底的頂部。c）由FhuA WT（左）或FhuA?CVF制成的膜的示意性俯視圖電子伏特d）FhuA膜在水和離子滲透方面進行表征。

圖2、a）在空氣-水界面處的FhuA膜并轉移到基底上。（i）吸附，（ii）壓縮，和（iii）在膜制造期間從0.32nmol FhuA WT涂布在磷酸鹽緩沖液頂部測量的谷面積-時間曲線在（ii）和（iii）中，戊二醛的注射用箭頭標記。B）相應的BAM成像顯示（i）在高達30 mN/m的表面壓力下均質的FhuA膜-1.（ii）表面壓力超逾30mN/m）（i）一個或（ii）兩個FhuA膜片的AFM圖像，所述膜片層疊在硅基底的頂部上（左半部分用注射器尖端刮去）。高度分布屬于圖像中的虛線，并且指示（i）5和（ii）9 nm的膜厚度。d）單個FhuAΔCVF的共聚焦熒光顯微鏡圖像，用熒光標記物標記的硅襯底上的薄膜片e）獨立地覆蓋TEM網(wǎng)格（淺灰色）的結構化碳膜中的孔（深灰色）的FhuA WT膜的HIM圖像。黑色區(qū)域顯示膜中的缺陷。

圖3、空氣-水界面處的FhuA膜BAM（布呂斯特角顯微鏡）圖。(a)在MPD緩沖液中擴散FhuA WT之前和(b)之后的Langmuir槽氣-水界面BAM圖像;和(c-f)在不同表面壓力下的屏障壓縮。涂敷后立即在空氣-水界面上吸附一層致密均勻的FhuA WT膜。FhuA WT膜可以被壓縮到高達25 mN/m的表面壓力，而不會表現(xiàn)出不均勻性。在表面壓力為30 mN/m時，在FhuA WT薄膜中可以看到垂直于壓縮方向的細長裂紋。

圖4、在FhuA單層膜上的AFM測量.a）當（i）未覆蓋和（ii）覆蓋有FhuA膜時在其中心具有單個孔的氮化硅膜窗口的示意圖.（iii）在PeakForce QNM模式下AFM成像期間FhuA膜涂覆的氮化硅膜窗口的橫截面（b-d）當（b）孔未被FhuA膜覆蓋，（c）孔被破裂的FhuAΔCVF膜覆蓋時，氮化硅膜窗口中的孔的AFM高度圖像膜，和（d）孔被一個完整的FhuAΔCVFtev膜層覆蓋（d）和（e）中的高度和變形圖像是同時獲得的，并且所有圖像都是在水中測量的。（d）和（e）中的高度和變形曲線分別屬于圖像中的虛線。

圖5、通過FhuA膜的水和離子滲透。a）覆蓋有氮化硅膜窗口的充水容器的示意圖，其用于測量FhuA WT膜的水滲透。由從杯內(nèi)到杯外的水蒸氣壓差驅動（pi-p0）（a）中所示的杯子的照片。c）FhuA WT膜的水滲透性為3.87×104 mol Pa-1 m?2 s-1（空參考25.13×104 mol Pa-1 m?2 s-1誤差條表示至少三個樣品的平均值的標準誤差。d）用于測量FhuA膜的離子滲透性的實驗裝置的示意圖。離子在電極之間擴散的唯一方式是滲透氮化硅膜窗口中的孔頂部的FhuA膜。e）在磷酸鹽緩沖液（10×10?3 m NaCl，10×10?3 m恒定斜率對應于4.0mS（空參比）、3.4mS（FhuA?CVF）、3.4mS（FhuA?CVF）和3.4mS（FhuA?CVF）的電極之間的恒定電導.

總結

通過具有納米孔的膜的過濾通常與高跨膜壓力和高能量消耗有關。這個問題可以通過減少各自的膜厚度來解決。本研究描述了一種簡單的方法來制備基于蛋白質納米孔的超薄膜，該膜具有優(yōu)異的透水性，比同類工業(yè)應用膜高出兩個數(shù)量級。此外，結合封閉或開放的蛋白質納米孔可以調(diào)整膜的離子滲透性。為了形成這樣的膜，跨膜蛋白鐵羥酸鹽攝取蛋白組分A(FhuA)或其開孔變體在Langmuir槽的空氣-水界面組裝，壓縮成致密膜，通過戊二醛交聯(lián)，并轉移到各種支撐材料上。這種方法可以制備具有高密度蛋白質納米孔的單層或多層膜。通過原子力顯微鏡(AFM)、氦離子顯微鏡和透射電子顯微鏡可以看到覆蓋直徑達5μm孔的獨立膜。AFM最大推力定量納米力學性能映射(PeakForce QNM)表明，厚度僅為5 nm的獨立單層膜具有顯著的力學穩(wěn)定性和彈性性能。這種新型蛋白質膜可以為節(jié)能納濾鋪平道路。